تولید نوترکیب ناحیه غنی از سیستئین انتهای کربوکسی متالوتیونین تیپ 1برنج (osmti-1b) و بررسی قابلیت اتصال آن به فلز کادمیوم

متالوتیونین ها (mt) گروهی از پروتئین های غنی از آمینواسیدهای سیستئین و با وزن مولکولی کم (5 تا 10 کیلودالتون) هستندکه می توانند از طریق گروه تیول آمینواسیدهای سیستئن به فلزات متصل شوند. بیشتر مطالعات بر روی متالوتیونین ها در گیاهان به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تحقیقات اندکی تاکنون بر روی نقش و ساختار متالوتیونین ها صورت گرفته است. تحقیق حاضر با هدف حذف انتهای آمینی از ایزوفرم osmti-1b متعلق به تیپ p1 متالوتیونین برنج و تولید فرم موتاسیون یافته c-osmti-1b و بررسی نقش آن در ایجاد تحمل به تنش فلزات کادمیوم، نیکل، روی و مس، در مقایسه با فرم طبیعی آن (osmti-1b) انجام شد. به منظور تولید قطعه ژنیc-osmti-1b از ژن osmti-1b، پرایمراختصاصی طراحی، و ژن مورد نظر توسط pcr تکثیر و در ناقل بیانی pet41a همسانه سازی گردید. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره تولید شده به میزبان بیانی e. coli سویه ی rosetta (de3) منتقل شد. با القاء بیان پروتئین توسط iptg، میزان قابل توجهی از پروتئین gst-c-osmti-1b تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده ی پروتئین-های gst-osmti-1b، gst-n-osmti-1b و gst-c-osmti-1b به فلزات سنگین کادمیوم و نیکل، و فلزات ضروری روی و مس، از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های cdcl2.h2o ، nicl2.6h2o، znso4.7h2o و cuso4 تعیین شد. همچنین اندازه گیری میزان کاهش فلز کادمیوم از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (aas) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن به فلزات کادمیوم، نیکل، روی و مس، در مقایسه با فرم gst-osmti-1b و gst-n-osmti-1b فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل بررسی تغییر در الگوی جذب نور و همچنین واکنش با معرف اِلمن استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی منحنی رشد سویه ی موتاسیون یافته به فلزات نشان داد که، بیان پروتئین gst-c-osmti-1b موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلزات کادمیوم، نیکل، روی و مس می شود. اندازه گیری میزان فلز کاهش یافته از محیط کشت توسط طیف سنجی جذب اتمی نشان داد سویه ی موتاسیون یافته قادر است ppm 4/63 از فلز کادمیوم را در محیط کشت جذب کند، که این میزان برای سویه بیان کننده پروتئین کامل gst-osmti-1b و gst-n-osmti-1b، به ترتیب ppm 4/93 و 2/44 بود. مقایسه مقدار فلز جذب شده در این سویه-ها نشان داد که میزان جذب فلز در سویه بیان کننده پروتئین gst-c-osmti-1b، تقریباً برابر با سویه بیان کننده پروتئین gst-osmti-1b می باشد. این امر می تواند به دلیل ایجاد ساختار فشرده تر حاصل از حذف انتهای آمینی باشد. برای بررسی واکنش المن با پروتئین هایی که به صورت مستقیم در معرض فلز قرار گرفته بودند، ابتدا فرم عاری از فلز (آپو پروتئین) آنها با استفاده از روش اسیدی کردن تولید، و سپس در معرض غلظت اشباع از یون های کادمیوم، نیکل و روی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که سرعت اولیه واکنش معرف المن با پروتئین در فرم بدون فلز بیشتر از پروتئین های حاوی کادمیوم، نیکل و روی بود، که این موضوع بیانگر جذب این فلزات توسط پروتئین می باشد. همچنین بررسی تغییر در الگوی جذب نور پروتئین موتاسیون یافته نتایج جذب کادمیوم، نیکل، روی و مس را توسط این پروتئین تائید کرد. به طور کلی نتایج بدست آمده، فعالیت پروتئین موتاسیون یافته را در جذب فلز حتی بدون انتهایی آمینی تأیید می کند؛ که این موضوع بیانگر قابلیت اتصال انتهای کربوکسی غنی از سیستئین osmti-1b، به طور مستقل از انتهای آمینی به فلز می باشد.